专题文章
日粮中同时补充精氨酸、维生素E和维生素C可改善肉仔鸡的心肺机能。
日粮中同时补充精氨酸、维生素E和维生素C可显著改善肉仔鸡在低温下的肺血管舒张，据DSM营养产品研究。需要进一步研究以阐明这些机制，研究人员说，但是此日粮处理似乎减少了腹水发生率。
摘要
本文进行两个试验以评估精氨酸、维生素E和维生素C在低温下对肉仔鸡的心肺机能和腹水指数的影响。给1日龄雄性肉仔鸡饲喂玉米豆粕基础日粮（对照，1.2%精氨酸和40 IU VE），或者基础日粮添加1%的精氨酸以及200IU VE (AE)， 500 mg VC(AC)，或同等量的VE和VC（AEC）。在间隔20分钟分别注射肾上腺素（EPI）（0.5 mg/kg 体重，静脉注射）、氨基胍（100 mg/kg 体重，静脉注射）以及N -硝基- L -精氨酸甲基酯（50 mg/kg 体重，静脉注射）前后记录临床上健康的被麻醉的鸡只（28-42日龄）的肺动脉压（PAP）和平均动脉压。通过重复测量方差分析法分析数据，使用 Student Newman-Keuls检验进行组内均值比较。注射Epi后30s所有鸡只PAP都增加，但是在ARC组PAP峰值低于其他组，而AE和AC组的鸡只PAP峰值低于对照组。在注射120s后，相比其他鸡只AEC组的鸡只PAP较低。在300s后所有组PAP都回到Epi前的水平。在注射氨基胍和N -硝基- L -精氨酸甲基酯60s后所有组PAP都增加 (P<0.05)，但是各组之间没有差异。各组之间平均动脉压反应没有差异。在注射Epi前后AEC组血浆NO高于所有其他组。这些结果表明AEC组的鸡只Epi引起PAP的振幅较低以及PAP增加的延长时间较少，这可能与血管舒张导致NO产量有关。AEC可能具有抗氧化应激的互补作用，保护内皮细胞以及保持NO的功能。
前言
原发性肺动脉高压综合征(PHS，腹水)是现代快速生长的肉鸡品系很常见的一种代谢病。当鸡只为5-6周龄接近上市日龄时，腹水死亡率达到高峰。这对行业来说代表巨大的损失，由于生产成本已经到达几乎最高点（Maxwell和Robertson, 1998）。腹水可由代谢率增加引发，这意味着需要更多的氧（Scheele等，1991；Buys等，1999；Wideman和Tackett，2000），在一个工作接近其生理极限的气体交换系统中，代谢需要的提高会导致细胞缺氧(Scheele等，1991)。为了避免细胞缺氧，增加出心输出量必须通过非顺从的肺血管推进，这就需要增加肺动脉压（PAP）和右心室（RV）的工作。PAP的持续增加导致右心室肥厚以及接下里来的扩张 (Peacock等，1990；Wideman，1999)。补充添加精氨酸降低了在低温下肉鸡腹水的发生率（Wideman等，1995; Tan等，2005），改善了肺血管舒张（(Wideman等，1996；Lorenzoni 和 Ruiz-Feria，2006），且便于家禽的血管舒张 (Martinez- Lemus等，1999)。然而，精氨酸对腹水发生率的作用效果是不一致的（Ruiz-Feria等，2001）。
氧化应激也涉及PHS的病因 (Peacock等，1990; Maxwel等1992; Enkvetchaku等，1993; Bottje 和Wideman，1995; Grobe等，2006)。持续高水平的PAP与缺氧、内皮损伤、活性氧的生成有关。慢性缺氧会增加活性氧浓度，且损害小鼠肺血管的内皮NO-依赖性的舒张 (Fresquet等，2006)。超氧阴离子通过缩短其半衰期而导致NO生物活性降低（Jung等，2003），从而减少了内皮血管舒张的潜在性 (Lopez-Lopez等，2001)。此外，超氧阴离子与NO的反应导致过氧亚硝基阴离子生成，过氧亚硝基阴离子是一种潜在的氧化剂，会直接对组织造成伤害 (Beckman等，1990; Szabo，1996)。
据报道患腹水的肉鸡在肺脏和肝脏内具有低浓度的维生素E（VE；Bottje等，1995）和抗坏血酸(Enkvetchakul 等，1993)。通过皮下植入补充添加VE降低了腹水的发生率，但是通过日粮补充添加没有此效果（Bottje 等，1995, 1997）。我们之前报道饲料中添加400 IU/kg 的VE，当与精氨酸同时添加时，在注射肾上腺素（Epi）后没有只添加精氨酸的鸡只肺血管舒张效果好（Lorenzoni和Ruiz-Feria, 2006）。此外，接受ARG和大量VE的鸡只TBA-活性物质浓度比接受常规饲料的高，这表明大量VE增加了氧化应激。VE与有机过氧化物反应，干扰涉及生育酚自由基形成的脂质过氧化物链式反应，生育酚自由基可作为强氧化剂并启动氧化过程(Schneider, 2005)。
维生素C已被证明通过降低α-生育酚自由基转化成α-生育酚有助于预防VE的强氧化活性，然后作为超级抗氧化剂（Carr 等，2000）。通过这个机制，已报道补充添加维生素C（VC）增加或恢复血浆和组织VE（Liu和Lee，1998； Keller等，2004）。此外，已报告抗坏血酸可通过减少失活NO的超氧自由基浓度而对血管内皮依赖性血管舒张具有有益作用(Dudgeon等，1998)。VC，当在饲料中补充添加500 mg/kg时，降低了肉鸡PHS的发生率（Ladmakhi 等，1997；Xiang等，2002）。然而，含亚麻油、VE和VC的日粮增加了肉鸡腹水的发生率（Walton等，2001）。
精氨酸、VE和VC对心肺机能和腹水指数的联合作用还没有研究过。作者假设精氨酸和抗氧化维生素对心血管功能具有互补作用，其中精氨酸提供额外的生产NO的基质，而VE和VC则提供抗氧化应激的保护作用。在本研究中，我们评估了精氨酸和VE或VC，或精氨酸、VE和VC组合在注射肾上腺素后对心肺反应的影响以及接下来间隔注射氨基胍(AG) 和N -硝基- L -精氨酸甲基酯(l-NAME)对血浆NO浓度，以及在冷环境下饲养的肉仔鸡的红细胞比积值的影响。
材料和方法
两个试验每个使用共96只1日龄雄性Cobb500肉仔鸡。仔鸡编翅号并在控光、控温以及控制通风的环境下饲养。所有肉鸡都在推荐的育雏温度下育雏直到16日龄。之后，所有肉鸡接受低温（16°C）直到6周龄以放大PHS的发生率。在统计分析前汇集两个试验获得的数据。
给所有仔鸡饲喂玉米豆粕基础日粮。，日粮养分满足或超过NRC（1994）营养需求，包括22.5 %的粗蛋白（CP）和3150kcal/kg 的代谢能（NE）（1-21d），或 19%的（CP）和3250 kcal/kg的NE (22 -42 d)。在两个生长阶段基础日粮包含1.2%（wt/wt）的精氨酸和 40 IU/kg的VE，日龄组成的细节以及微量养分在其他地方有描述。将鸡只分为4组。对照组（CTL，基础日粮）、高精氨酸和高VE组[AE; 基础日粮加上1%的1-精氨酸盐酸盐（加拿大安大略省奥克维尔Sigma公司）和200 IU 的DL - α-维生素E醋酸酯（加拿大安大略省艾尔帝斯曼营养产品Rovimix E 50 SD）]；高精氨酸和VC组（AC>;基础日粮加上1%精氨酸和500 mg/kg的抗坏血酸；Sigma)；以及高精氨酸、高VE和VC组（AEC基础日粮加上1%的精氨酸、200IU的α-维生素E醋酸酯以及500 mg/kg的 VC）。日粮没有制粒且小堆混合以预防抗坏血酸失活。
手术
从28-42日龄中，选择临床健康的鸡只进行心肺机能的评估（试验1和2每组分别n=7和n=16）鸡只使用巴比妥（5,5 -烯丙基-巴比妥酸，Dial mixture, Sigma, St. Louis, MO；50 mg/kg体重，肌肉注射）麻醉，盐酸利多卡因（Xylocaine，Astra- Zeneca Canada Inc., Mississauga, Ontario, Canada；2%皮下注射）作为在切口补充的局部麻醉剂。将鸡背卧位拴住，翅膀和腿展开在加热外科板上，外科板保持30℃ 的表面温度和20 °的平视角。将左肱动脉分离并用30厘米的肝素聚乙烯管(PE-50, Becton Dickinson Canada Inc., Oakville, Ontario, Canada)插管。左肱静脉用30厘米的肝素硅橡胶管（0.012 内径× 0.025外径，VWR International, Mississauga, Ontario, Canada）插管，近端提前通过静脉和RV直到到达肺动脉。PE-50聚乙烯管和硅橡胶管两端均连接在与Transbridge前置放大器接口的血压传感器，再接到Biopac MP100数据采集系统，该系统使用Acknowledge软件(Biopac Systems Inc., Goleta, CA)进行连续测量PAP(mm Hg)、平均动脉压（MAP，毫米汞柱）和心率 (HR, 次/分钟)。
试验方案
一旦鸡只被插管，则将其稳定10分钟。在这段时间内，在注射Epi[4-（1-羟基- 2- [甲基氨基]乙基）-1,2 -苯二酚盐酸盐，Sigma, St. Louis, MO]（0.5 mg/kg 体重，静脉注射）后300和60秒处读取代表性的 PAP和MAP值以获取基础值。Epi产生很强的血管舒张效果（Smith等，2000），增加了MAP和PAP。评估血管舒张能力是通过在每次注射挑战后测量PAP的增量以及每个日粮处理的鸡只PAP回到基础测量值所花费的时间进行的。在Epi挑战后在30、60、120、300、600、720和1200秒处测量PAP、MAP和HR反应。在Epi挑战后在1200秒处，给鸡只注射AG（100 mg/kg体重，静脉注射），在同样的时间间隔内（30、60、120、300、600、720和1200）记录PAP、MAP和HR。在AG挑战后1200秒用 l-NAME（500 mg/kg体重，静脉注射）进行第三次注射，并在之前描述的时间间隔内记录同样的指数。
Biopac MP100 系统监控两个主要渠道，包括PAP和MAP。在上述提及的代表性采样时间处10秒记录期间将这些指数值电子平均化。所用平均数据的方案之前被证实能准确补偿脉压和呼吸周期对PAP和MAP的影响 (Wideman等，1996)。与每个采样时间间隔一致在记录PAP时计数收缩期峰值以获取心率。在每个试验末，人道杀死鸡只并割取心脏以测量RV到总心室的比值（RV:TV）作为PHS的指标(Burton等，1968；Cueva等，1974)。所有动物程序都获得麦吉尔大学动物保健委员会批准。
测定血液中的NO
在Epi挑战之前5分钟和注射l-NAME后20分钟用含EDTA的真空管 (Becton Dickinson Canada Inc.) 收集血样(2 mL)以测定NO。通过离心分离血浆并在-20°C下储藏直至分析。使用Nitrate/Nitrite Colorimetric 分析试剂盒测定血浆NO浓度(Cayman Chemical, Ann Arbor MI)。本测试基于一个两步骤的方法，第一步使用硝酸还原酶将亚硝酸盐转化为硝酸盐，第二步是添加Griess试剂，将硝酸盐转化成深紫色的偶氮化合物。在96格酶标板上进行分析，在540 nm处测量偶氮发色团的吸光度。
红细胞比积，RV:TV 比值和PHS死亡率
在第3-6周记录红细胞比积值。随机抓取鸡只（试验一n=8-9，试验二n=18），从翅静脉采集血样到血毛细血管中，并在9000× g下离心3分钟。检查试验期间死亡的鸡只的心脏衰竭以及腹腔的腹水病变情况。摘除心脏，小心切断左心室的RV，并计算RV:TV比值（Burton等，1968；Cueva等，1974）。在6周末，人道杀死所有鸡只并计算RV:TV比值。
统计分析
在两个试验中通过单向方差分析法对体重、RV:TV比值、红细胞比积、血浆一氧化氮以及采样点的PAP、MAP和HR值进行分析，并通过Student-Newman-Keuls检验进行均值比较。使用配对t检验比较处理组内注射前后NO的血浆浓度，P<0.05表示差异显著。使用重复测量的SigmaStat的方差分析法(Jandel Scientific, 1994)分析处理组内随着时间变化的PAP、MAP和HR，使用Student-Newman-Keuls检验进行均值比较。在-300和-60s处采样作为Epi挑战的基础值。 Epi挑战后1200s处采样当作AG挑战的基础测量值，以及2400s处采样当作l-NAME挑战的基础测量值。当在挑战期间PAP、MAP和HR与它们各自的基础值统计学差异显著(P<0.05)时，表明差异显著。PAP、MAP、HR和血浆NO的数据在两个试验中都高度一致且在分析之前汇集到一起。P<0.05表示差异显著。
结果和讨论
当补充添加ARG超过NRC(1994) 需求时，肺血管舒张得到改善，且这归于一氧化氮产量增加所致（Wideman，1996；Lorenzoni和Ruiz-Feria，2006）。此外，抗氧化剂如VE (Bottje等，1995)和VC (Xiang等，2002)表明会降低PHS死亡率。 然而，当单独使用时(Ruiz-Feria等，2001；Lorenzoni和Ruiz-Feria，2006；Walton等，2001)，ARG、VE或VC对肺血管功能和腹水发生率的作用效果不一致。作者假设精氨酸和抗氧化维生素对心肺功能具有互补作用，其中精氨酸提供额外的生产NO的基质，而抗氧化剂维生素则提供预防抗氧化应激的作用。
在不同处理组之间临床健康的肉鸡之间基础PAP（挑战后）差异不显著(图1；-300和-60 秒)。在Epi挑战后所有处理组内30秒处的PAP显著增加(P<0.05；30秒VS基础PAP)。Epi挑战后的PAP保持比基础测量值高，在CTL和AE组一直到300秒处都保持高于基础测量值，但是AC和AEC组在300秒处没有保持高于基础测量值。此外，当比较各处理间PAP在30s处（在PAP的高峰反应）时，AEC组的PAP是最低的（P < 0.05），CTL组为最大，而AE和AC组出于中间位置（低于CTL组，高于AEC组）以及相似的PAP。在 60-、120-和300-秒处，CTL组的PAP保持高于AEC组的PAP，但是与AE和AC组的PAP没有差异。 在Epi挑战后60秒，AEC组的PAP低于AC组的PAP，但是与AE组的PAP没有差异。在挑战后120秒，AEC组的PAP低于AE和AC组的PAP，但是在挑战后300秒，AE、AC和AEC组之间的PAP没有差异。在600秒记录处，各处理间的PAP没有差异。
因此，在急性Epi挑战后AEC组的鸡只表现最好的肺血管舒张反应，这点可从30秒处PAP较低的峰值，从60秒到300秒较低的PAP以及PAP快速回归到基础测量值看出，而AE和AC组的鸡只比AEC组鸡只具有更好的肺血管舒张反应。这些结果表明添加ARG、VE和VC对心肺反应具有相加作用。额外的ARG的血浆浓度可有助于酶法生成NO，而抗氧化剂维生素可保护NO的生物活性并保护内皮细胞的完整性，并以这种方式，改善肺的血管舒张能力。在这方面，我们的结果还表明，VE或VC结合ARG，对抗氧化应激提供有限的保护，但是当两个抗氧化维生素一起添加时，保护作用增强。例如，超氧阴离子（·O2 -）通过缩短其半衰期而造成在其他效果间，内皮血管舒张下降而导致NO生物利用率下降(Lopez-Lopez等，2001)。此外·O2与NO的反应导致过氧化亚硝酸盐生成，过氧化亚硝酸盐是一种有效的氧化剂，会通过氧化反应、过氧化反应以及脂类、蛋白和DNA的硝化反应而对组织造成直接损伤（Beckman等, 1990; Szabo, 996）。VE和VC对抗氧化剂能力的相加作用在高温饲养的产蛋母鸡（Sahin等，2002）以及载脂蛋白E-缺乏的小鼠(Nespereira等，2003；Rodriguez-Gomez等，2005)上已有报告。据文件证实VC确保了α-生育酚从α-生育酚自由基的再生，因而作为“超级抗氧化剂“抑制氧化而阻止了VE的强氧化能力(Carr等，2000)。我们之前报道，与ARG一起补充VE（400 IU/kg）增加了在低温下饲养的肉鸡血浆中的TBA-活性物质。仔鸡可合成VC，但是在集约化饲养和应激源如快速生长、热、或冷环境下，鸡只可能不能合成足量的VC（Pardue和Thaxton, 1986）。此外，ARG在某些环境下可成为强氧化剂；例如，较高浓度的NO生产与超氧自由基有关（Hishikawa 和 Lüscher, 1997），且Ruiz-Feria等(2004)报告高浓度的ARG与鸡只大动脉的血管内皮损伤有关，可能是由于氧化应激增加所致。这些试验的结果强烈表明VE和VC组合对改善心肺性能和降低肺动脉高压具有相加效果，且这些通过降低氧化应激和增加NO的利用率可能获得调解，见下列讨论。
氨基胍是NO合成酶（NOS）的诱导形式的特异性抑制剂。在AG挑战后，与基础值相比，所有处理组30秒内的PAP 值升高 (P < 0.05)，在120秒后除了AEC组所有处理组都回到基础测量值，PAP在120秒之前回到基础测量值。在AG挑战后所有处理组在60秒处记录PAP的峰值（1260秒，图1）；然而，在CTL组的峰期高于AEC组，而AE和AC组的PAP峰值出于中间位置，其不同于CTL或AEC组的PAP峰值。Wideman等(2006)报告AG稳定，但是没有增加，在微粒注射前的阶段内，PAP没有增加。同样，Bowen 等(2006) 报告在腹水敏感或抗腹水品系肉鸡上在注射AG后10分钟PAP没有增加。另一方面，Teshfam等(2006)报告低温增加了内皮细胞NOS和诱导性NOS（iNOS）的基因表达，且 Schroeder等(2000)观察到形成肝肺高压的大鼠肺内皮细胞的NOS活性表现9倍的增加。因此，在这些试验中在AG挑战后所记录的PAP的增加可能是鸡只处于低温以及形成PHS造成的结果，这进一步支持ARG、VE和VC在减少低温对肺血管舒张的不利作用上的互补效果。
在AC和AEC组注射l- NAME后30秒PAP增加，在CTL和AE组在60秒时增加，所有组到300秒都保持上升，但是各处理之间差异不显著。l- NAME挑战比AG挑战对PAP具有更长的持续效果。当内皮细胞NOS和iNOS受l- NAME抑制时，NO合成随后的降低导致肺动脉血管舒张（(Martinez-Lemus等，1999, 2003; Wideman 和Chapman, 2004）。Wideman等(2005)报告l-NAME注射 (40 mg)在5分钟内没有导致PAP的增加，但是通过注射纤维素微粒有效地扩大了肺血管的舒张。在这些试验中鸡只对1-NAME的反应可通过剂量差异（50 mg/kg体重）、鸡只暴露在低温环境中（这可能开始造成内皮细胞损害）进行解释，以及接受之前的挑战，降低了NO的可用性进行解释。
MAP（图2）显示如PAP所描述的同样的趋势。MAP在Epi挑战后在30秒内发生第一个峰值且在Epi挑战后在300秒内回到基础测量值。在AG挑战后60秒MAP增加并在挑战后120秒所有组都回到基础测量值。在1-NAME挑战后60秒，MAP增加并在600秒所有组都回到基础测量值。在任一采样时间点各处理间MAP没有差异。在Epi挑战后所有组的心率都降低并在300秒内所有组都回到原始测量值（数据没有显示）。肾上腺素触发总外周阻力和肺血管阻力增加，尽管HR和心输出量降低但这增加了 MAP和PAP（Wideman，1999年）。在AG和1-NAME挑战后HR也下降(Wideman, 1999; Wideman等, 2005; Lorenzoni和Ruiz-Feria, 2006)。在这些试验中，各处理间MAP和HR都没有表现差异，且各处理间回到基础测量值的时间都类似，这表明上述PAP的差异可归因于肺血管张力的组件差异。
溶于生物体液的NO在的体内半衰期只有几秒钟，在体液中NO和活性氮迅速转化成稳定的氧化产物亚硝酸盐和硝酸盐（Dweik等，2001）。在Epi挑战前，我们发现日粮补充ARG结合抗氧化维生素（AEC组）显著增加了血液中的NO的血浆浓度（亚硝酸盐和硝酸盐），与饲喂ARG加上AE或AC抗氧化维生素组或常规日粮相比。此外，在Epi挑战前，AE和AC组鸡只之间的NO浓度没有差异。，但是当与CTL组鸡只的NO浓度比较时较大。这些结果强烈说明AEC在Epi挑战后表现的较好的肺血管舒张能力（图1）归因于NO较大的可用性。此外，在Epi挑战后表现中间的心肺血管舒张的鸡只血管中也具有中等浓度的NO代谢物，支持VE和VC具有互补作用，可通过降低氧化应激保护和加强NO的可用性的想法。除了它们的抗氧化作用外，VC和VE表明可通过四氢生物蝶呤再生和抑制蛋白激酶C的活性而改善内皮细胞源NO的合成 (Carr等，2000)。正如预期，血浆NO代谢物的浓度在1-NAME挑战后下降，然而，即使在1-NAME挑战后，AEC组的鸡只比其他处理组的鸡只NO浓度高（试验1和2数据汇集），进一步说明同时补充添加ARG、VE和VC对NO可用性的有益作用。
在3周龄（暴露于低温下5天）时，CTL组的红细胞比积值比AEC组大，但在第4周，各组间没有差异（图3）。然而，在第5周和第6周，AEC组鸡只的红细胞比积值最低（P <0.05），而CTL组鸡只最大。 AE和AC组的红细胞比积值相似，但与CTL组相比比较低，而与AEC组鸡只相比则较大（图3）。这些红细胞比积值大于以前 Maxwell等（1992）报告值，但与我们以前的报告值类似（Lorenzoni和Ruiz- Feria, 2006）。较大的红细胞比积值与持续缺氧有关（Yersin等，1992），并已被证明与腹水敏感度相关 (Wideman等，1998)。在本试验中红细胞比积值与心肺机能和血浆NO浓度结果相匹配，进一步支持ARG和抗氧化剂对气体交换率和AEC鸡只所有心肺机能的作用，其次是饲喂ARG和VE或VC。CTL组的腹水死亡率数字较大（9/48），其次分别是AC组（8/48）、AE组(6/48)和AEC组 (4/48)。BW和.RV:TV比值各处理之间没有差异（数据没有显示）。本试验的结果还表明当精氨酸盐酸以1%(wt/wt)的量添加时H+增加对鸡只没有不利影响，且根据鸡的机制控制酸碱平衡很容易做到。
总之，同时补充ARG、VE和VC可显著改善在低温下饲养的经过急性Epi挑战后的肉仔鸡在低温下肺血管舒张。肺血管舒张的改善与血浆NO浓度增加以及低的红细胞比积浓度有关。因此，同时补充ARG、VE和VC通过给NOS更多的基质从而提高NO的生物利用率还可能通过降低与氧化应激有关的NO的损失以及通过NO-源自由基降低内皮细胞损害从而对心肺性能具有互补作用。还需进行进一步研究以阐明这些机制。
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