专题文章
仔鸡巨噬细胞对病原源性分子CpG-ODN应答的调节机制
根据Iowa大学2011年畜牧业报告，本研究加大了通过发现疾病应答路径来开发疫苗的可能性。
总结和意义
在本研究中家禽特异性Toll样受体（TLR）基因的调节和活动机制特点是在仔鸡的巨噬细胞中。仔鸡TRL15是一种新模式的识别受体，其同源配基未知且结构不同于其他TRLs。在巨噬细胞培养基中筛选各种刺激物时，我们得出结论TLR15，与TLR2和TLR12结合，参与巨噬细胞中的CpG寡核苷酸（ODN）的应答。我们通过使用抑制剂ODN进一步证实巨噬细胞中的CpG反应。此外，在用导致IL1B表达的CpG-ODNs刺激后我们测定了MyD88衔接子分子的路径使用情况。本研究加大了通过发现疾病反应路径来开发疫苗的可能性。
前言
仔鸡的天然免疫反应对清除病原和刺激适应性免疫应答非常重要。巨噬细胞是天然免疫反应的重要组分并通过特异性受体调节其功能。TLRs(TLR2,、TLR3、TLR4、TLR9和TLR7)的细胞外配体结合域立刻识别病原相关分子模式，包括脂蛋白、双链RNA、脂多糖、未甲基化的CpG和单链RNA。哺乳动物和鸟类的TLR存在本质差异。哺乳动物没有TLR15，而鸟类没有TLR9。不仅各品种TLR基因家族的成员不同，而且TLRs的调节机制各品种间也不同。哺乳动物的TLR4使用MyD88依赖性和非依赖性路径，但是仔鸡TLR4没有。到目前为止，报道中没有仔鸡TLR使用两种路径。
材料和方法
我们使用仔鸡巨噬细胞系HD11作为模型。细胞在41℃和5% CO2下培养，并使用几种剂量的病原分子（PAM3CSK4, E.coli 和 S.enteritidis源LPS、双链RNA、imidazoqualinoline、 A、B和C型CpG-ODNs）分别刺激TLRs 3小时和24小时。使用定量PCR测量细胞因子（IL10、IL1B、IFNA）和TLRs (TLR15、TLR2、TLR21、TLR4)和28s基因的表达。使用梯度稀释制备所有受试基因的标准曲线。C（t）值使用标准化28s关门基因计算出。用Turkey HSD测试进行剂量和时间的比较来定义刺激物诱导免疫应答的最佳浓度。P ≤ 0.05表示差异显著。通过定量PCR测定抑制剂ODN对CpG-ODN刺激仔鸡巨噬细胞的作用效果。我们直接在MyD88基因上设计了siRNAs。在优化转染条件下，我们使用试剂lipofectamine RNAiMAX 将MyD88 siRNAs导入到巨噬细胞中。在荧光显微镜下从7个不同的位置检测接受荧光siRNAs的细胞数，然后求平均计算传转效率。
结果和讨论
在巨噬细胞中用B和C型CpG-ODN、PAM3CSK4、E.coli 和S.enteritidis源LPS 诱导刺激3小时后，TLR15明显上调(P < 0.05)。为了证实TLR15 对CpG-ODN诱导的应答性，我们通过QPCR测量了CpG-ODN 抑制剂对TLR15、TLR21、IL1B、IFNA、IL6和IL10表达的作用效果。虽然TLR15和 IL1B在抑制剂处理后下调(P < 0.05)，但TLR21上调。在CpG-ODN 诱导后IL1B具有与TLR15一样的基因表达应答(P < 0.05)。我们的结果表明在仔鸡巨噬细胞中对不同类型的CpG-ODN 应答需要多个受体且每个受体在表达上都表现出差异。为了探索在仔鸡巨噬细胞汇总CpG-ODN应答的活动机制，我们检测了TLR15和TLR21的MyD88依赖性。巨噬细胞同时用三个siRNAs转染表明，与阴性siRNA转染巨噬细胞相比，在MyD88 mRNA 基因的表达中降低了70% (P = 0.03)。虽然用完整MyD88在CpG-ODN 刺激细胞上明显诱导出IL1B基因，但此诱导在MyD88基因表达中降低70%的细胞中消失。本研究提供了仔鸡巨噬细胞发送信号的TLR对MyD88依赖性的首要证据。因此，我们列出了哺乳动物和鸟类CpG-ODN 应答的活动模式的证据。
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2011年3月
